מנגנונים של תהליכי חימצון הנגרמים כתוצאה מפעילות רדיקלים או צורונים פעילים אחרים

Transcript

1 מנגנונים של תהליכי חימצון הנגרמים כתוצאה מפעילות רדיקלים או צורונים פעילים אחרים מחקר לשם מילוי חלקי של הדרישות לקבלת תואר "דוקטור לפילוסופיה" מאת סנדרה רחמילוביץ קאליס הוגש לסינאט אוניברסיטת בן גוריון בנגב נובמבר 2009 כסלו תש"ע באר שבע

2 מנגנונים של תהליכי חימצון הנגרמים כתוצאה מפעילות רדיקלים או צורונים פעילים אחרים מחקר לשם מילוי חלקי של הדרישות לקבלת תואר "דוקטור לפילוסופיה" מאת סנדרה רחמילוביץ קאליס הוגש לסינאט אוניברסיטת בן גוריון בנגב אישור המנחים אישור דיקן בית הספר ללימודי מחקר מתקדמים ע"ש קרייטמן נובמבר 2009 כסלו תש"ע באר שבע

3 תודתי הרבה למנחים שלי פרופ' דן מאירשטיין ופרופ' נעמי מאירשטיין על ההדרכה, התמיכה הסבלנות והידע הרב שהענקתם לי. תודתי לדר' אלכסנדרה מסארווה על העזרה הרבה. תודה לכל חברי הקבוצה על העידוד והתמיכה.

4 עבודה זו מוקדשת לאבי, סורין, לבעלי, אמיר ולבני, איתי על אהבתם, סבלנותם ועזרתם הרבה.

5 העבודה נעשתה בהדרכת פרופ' דן מאירשטיין פרופ' נעמי מאירשטיין במחלקה לכימיה בפקולטה למדעי הטבע

6 תקציר בעבודה זו נחקרו מנגנונים של תהליכי חימצון כתוצאה מפעילות רדיקלים או צורונים פעילים אחרים. העבודה עסקה בחקר מנגנון תגובת פנטון, שהיא התגובה בין ברזל דו ערכי ומי-חמצן. מרבית Fe II aq + H 2 O 2 Fe IV =O + H 2 O /Fe III aq +. OH Fe IV =O /. OH + Fe II aq 2Fe III aq / Fe III aq Fe II aq + H 2 O 2 Fe II 2Fe III aq בתגובה זו נוצרים רדיקלי הידרוקסיל או צורוני ביניים מחמצנים אחרים שנמצאו אחראים לזקנה וכן למגוון מחלות כגון: סרטן, פרקינסון, אלצהיימר, סכיזופרניה, טרשת עורקים וכו'. המנגנונים נחקרו ע"י: 1. בדיקת הקינטיקה של תגובת פנטון ופרמטרי שפעול עבור התגובה. התוצאות והמסקנות הן: א. קבועי המהירות בעודף ברזל ובעודף מי חמצן אינם זהים. ב. בעודף מי חמצן קיימת תגובה נוספת בין הברזל התלת ערכי הנוצר בתגובת פנטון לבין מי החמצן ונוצר קומפלקס פראוקסו ברזל. Fe III aq + H 2 O 2 Fe III ( - O 2 H) aq + H + תגובה זו הינה בעלת השפעה על המנגנון וקבועי המהירות המתקבלים. הקומפלקס מגיב עם ברזל דו ערכי בתגובה דמויית פנטון עם קבוע קצב המהיר בארבעה סדרי גודל מזה של תגובת פנטון. Fe(H 2 O) 6 2+ aq + Fe III ( - O 2 H) aq Fe III aq + Fe IV =O/(Fe III aq +. OH) + H 2 O קיומה של תגובה זו והשפעתה על המנגנון מרמזת על כך שתגובת פנטון היא מורכבת יותר ממה שנהוג לחשוב ובתנאים שונים מתקיימים מנגנונים שונים. ייתכן ובעודף ברזל הצורון העיקרי שיתקבל יהיה רדיקל ההידרוקסיל בעוד שבעודף מי חמצן יתכן שיון הפריל יהיה הצורון העיקרי בתמיסה. 2. בדיקת מנגנון תגובת פנטון בנוכחות חמצן וסובסטרטים אורגניים שונים: כהלים וסוכרים. התוצאות והמסקנות הן: א. בנוכחות הסובסטרטים מתרחשת תגובת שרשרת וניצולת הברזל התלת ערכי עולה לינארית עם העלייה במספר קבוצות ה C-OC וה C-OH שעל הסובסטרט. ב. הברזל הדו ערכי המאתחל את תגובת השרשרת מביא גם לטרמינציה של תגובת השרשרת ע"י תגובה עם הצורונים הפעילים הנוצרים בתגובת השרשרת. 1

7 ג. הוספה של חומרים שונים למערכת שאינם מקטלזים את תגובת השרשרת מביאים לטרמינציה ע"י תגובתם עם RI -. OH/Fe IV =O Fe II + H 2 O 2 [Fe II. H 2 O 2 ]. OH/Fe IV =O + H 2 O. OH/Fe IV =O + R 1 R 2 CHOH Fe III -OH + R 1 R 2 (OH)C. ( R. ) R. + O 2 RO 2. RO 2. R 1 R 2 C=O + HO. 2 RO 2. \HO 2. + Fe II Fe III -OOR 2+ Fe III -OOH 2+ H+ Fe III + HOOH Fe III -OOR 2+ H+ Fe III + HOOR Fe III -OOR 2+ + Fe II H+ RI + Fe III + ROH II 2H+ RI + Fe 2Fe III הצורונים הפעילים הנוצרים בתגובת השרשרת. ד. המנגנון שהוצע עבור תגובת השרשרת הינו: מנגנון זה אומת ע"י ביצוע סימולציה. ה. הטרמינציה של תגובת השרשרת מתבצעת ע"י הרדיקלים השניוניים ולא בתגובות הרדיקלים או צורוני הביניים הראשוניים שנוצרו בתגובת פנטון. תגובת השרשרת בסוכרים יכולה להוביל לנזקים רבים בפוליסכרידים שהינם בעלי מספר רב של קבוצות C-OC ו- C-OH הנמצאים בתאים ואלו הנמצאים על פני ממברנת התא האחראים לזיהוי ותקשורת בין תאית. 3. בדיקת השפעת הליגנדים הפוספטיים: פירופוספט, (TPP) Tri-polyphosphate ו ATP על קצב תגובת פנטון. התוצאות והמסקנות הן: א. שלושת הליגנדים מאיצים בצורה ניכרת את תגובת פנטון. קבועי הקצב הנצפים בנוכחות הליגנדים לעומת הקבוע של תגובת פנטון ללא ליגנד הם: Ligand No ligand pyrophosphate TPP ATP Rate k = 76 M -1 s -1 k app = M -1 s -1 k app = M -1 s -1 k app = M -1 s -1 ב. קבועי המהירות תלויים בריכוזי הליגנד ועולים עם העלייה בריכוז הליגנד. 2

8 ג. תוצאה זו מעידה שהירידה בניצולת רדיקל ההידרוקסיל בתגובת פנטון בנוכחת ליגנדים אלו אינה נובעת מהאטת התגובה כפי שהוצע, אלא ממניעת תגובת השרשרת, כנראה לאור היצוב של הקומפלקסים,Fe III L m כאשר L הוא ליגנד פוספטי. 4. בדיקת מנגנוני ההגנה של האנטיאוקסידנטים חומצה אסקורבית, N-acetyl cysteine וגלוטתיון לחמצון דאוקסיריבוז ע"י רדיקל ההידרוקסיל. התוצאות והמסקנות הן: א. אנטיאוקסידנטים אלו מעכבים חימצון דאוקסיריבוז בצורה שונה למרות שקצב התגובה שלהם עם רדיקלי ההידרוקסיל הוא דומה. ב. האנטיאוקסידנטים התיוליים פועלים במנגנון שונה מחומצה אסקורבית. החומצה האסקורבית יכולה להגן על הדאוקסיריבוז רק ע"י תגובה עם רדיקלי הידרוקסיל המונעת תגובה של הרדיקל עם דאוקסיריבוז, התיולים יכולים גם לחזר רדיקלי דאוקסיריבוז שעברו חמצון. ג. התיולים יוצרים רדיקלי תייל פעילים היכולים גם לגרום לנזקים חמצוניים לדאוקסיריבוז ולסובסטרטים אורגניים אחרים. ד. אנטיאוקסידנטים פועלים טוב יותר בצורה סינרגיסטית מאשר כל אחד מהם בנפרד. הוספת חומצה אסקורבית ל GSH מורידה את חימצון הדאוקסיריבוז יותר מסך ההורדה של שניהם כאשר הם מגיבים בנפרד. ה. פעילות האנטיאוקסידנטים תלויה במדיום שבו הם נמצאים ולא רק במהירות התגובה שלהם עם רדיקלי הידרוקסיל. במערכות שונות אנטיאוקסידנטים אלו פועלים גם ע"י חיזור סובסטרטים שעברו חמצון. לפיכך, ניתן לומר שבמערכות ביולוגיות שבהן יש ריכוזים נמוכים של אנטיאוקסידנטים, הפעילות העיקרית של האנטיאוקסידנטים היא בעיקר חיזור רדיקלים שניוניים שעברו חימצון ע"י ROS ולאו דוקא תגובה עם רדיקלי ההידרוקסיל. 3

9 1. מבוא כללי 1.1 נזקי רדיקלים נזקים רבים במערכות ביולוגיות מיוחסים לתגובות של נגזרות פעילות של חמצן (Reactive Oxygen Species) ROS ו/או נגזרות פעילות של חנקן (Reactive Nitrogen Species) RNS עם רכיבי רקמות ביולוגיות. נגזרות אלו מתחלקות ל- 2 צורות עיקריות : רדיקלים: א.,RO. (alkokxyl),o 2.- (superoxide),ho 2. (hydroperoxyl),no. (nitric oxide). OH וכדומה. (hydroxyl) מולקולות ב. שאינן רדיקלים כגון:( nitrosyl ) H 2 O 2,HOCl (hypochlorous acid),o 3 (ozone),no - peroxide) (hydrogen וכדומה. 1,2 צורונים אלה יכולים לגרום לפגיעה בפעילות אנזימים וחלבונים שונים וכן לגרום לנזק לממברנת התא. אחת הסכנות המשמעותיות היכולות להיגרם כתוצאה מפעילותם הינה פגיעה ב.DNA פגיעה זו יכולה לגרום לשנויים במבנהו וליצירת מוטציות. תגובות צורונים אלו עם רקמות שונות נמצאו אחראיות לזקנה וכן למגוון מחלות כגון: סרטן, פרקינסון, אלצהיימר, סכיזופרניה, טרשת עורקים, דלקת פרקים וכו' היווצרות רדיקלים רדיקלים יכולים להיווצר בתהליך פירוק הומוליטי של קשר קוולנטי. פירוק זה מצריך אנרגיה גבוהה התלויה בחוזק הקשר הקוולנטי או לחילופין, בתהליכי איבוד/סיפוח של אלקטרונים בפעולות חמצון חיזור. מקור הרדיקלים במערכות פיזיולוגיות נובע מ:.- תהליכים בגוף הגורמים ליצירת רדיקלים, חלקם באופן רצוי כגון O 2 ו. NO בגרנולוציטים ומאקרופגים במטרה לפגוע במיקרואורגניזמים העלולים לגרום לנזקים באורגניזם, וחלקם באופן לא מכוון כגון דליפת הצורונים הנוצרים בגרנולוציטים ובמקרופגים לאזורים בלתי רצויים בתא וברקמות. אך המקור העיקרי להיווצרות צורונים אלו הוא בדליפת אלקטרונים משרשרת מעבר האלקטרונים בתהליך הנשימה 7,8 התאית. עם בנוסף להיווצרות צורונים אלה כתוצאה מתהליכים פיזיולוגים הם יכולים להיווצר בגוף גם כתוצר של גורמים סביבתיים כגון חשיפה לקרינה מייננת, קרינת,uv NO. 7 חומרים כימיים ספציפיים. רדיקל הסופראוקסיד הנוצר במיטוכונדריה כתוצר של שרשרת מעבר האלקטרונים אינו פעיל ואינו גורם לנזק לכשעצמו אך מהווה מקור להיווצרות מי חמצן בתגובת דיסמוטציה (תגובה (1.1)), יוצר פראוקסוניטריט בתגובה וכמו כן מסוגל לחזר או לחמצן קומפלקסי מתכות מעבר. (1.1) 2O H + H 2 O 2 + O 2 4

10 מי החמצן, בדומה לשאר הפראוקסידים, הם יציבים יחסית אך הופכים לפעילים בנוכחות קומפלקסי מתכות המעבר ויכולים לגרום לתגובת פנטון או לתגובות דמויות פנטון המובילות ליצירת רדיקל ההידרוקסיל. בהמשך נדון בהרחבה באפשרות שבתגובות אלו לא נוצרים רדיקלי הידרוקסיל. (1.2) H 2 O 2 + Fe(H 2 O) OH + OH - + Fe(H 2 O) 6 3+ k = (42-79) M -1 s -1 9 (1.3) H 2 O 2 + M n L m. OH + OH - + M n+1 L m רדיקלי ההידרוקסיל מגיבים מהר מאוד עם כל רכיבי התא כגון חלבונים, DNA ושומנים, לכן הם בעלי זמן חיים קצר של s ומהווים סכנה למערכות ביולוגיות. בניגוד לסופראוקסידים בגוף היכולים להיות מנוטרלים ע"י,SOD רדיקלי הידרוקסיל אינם מנוטרלים ע"י מערכות אנזימטיות בגוף מולקולה אחרת המצויה בסביבתם ולכן מאחר והם מגיבים מהר כמעט עם כל זמן החיים שלהם קצר מקצב הדיפוזיה שלהם לאתר פעיל ביולוגית. תרכובות ארומטיות או כאלו עם קשרי פחמן כפולים עוברות סיפוח של רדיקלי ההידרוקסיל. בתרכובות רוויות רדיקל ההידרוקסיל תולש מימן בד"כ מהאתר שבו יש את הקשר C-H 11 תלישת מימן גבוהה מזו שעבור סיפוח ולכן כאשר קיימת תחרות תגובת הסיפוח מועדפת. 10 החלש ביותר. אנרגיית השפעול עבור -H 2 O (1.4). OH + RH R. (1.5). OH + RCH=CHR'. CHR'CH(OH)R H OH (1.6) +. OH פעילות הרדיקלים פעילות הצורונים הפעילים עם רכיבי רקמות ביולוגיות, כגון חומצות שומן, חלבונים וחומצות גרעין, מאתחלות נזק נקודתי שבסופו של דבר יכול לגרום לנזק מהותי לרקמה. ממברנות התא עשירות בפחמימנים לא רוויים המגיבים במהירות עם רדיקלים מחמצנים. חמצון זה יכול להוביל לתגובת שרשרת במנגנון המוצג בסכימה 1 כאשר L מציין חומצת שומן. 5

11 סכימה 1 12 ההידרופראוקסידים הנוצרים במנגנון זה יציבים למדי. האיום העיקרי ליציבותם הם קומפלקסי מתכות המעבר הגורמים לפירוקם לרדיקלים ומאתחלים חמצון נוסף של שומנים. נזק לממברנה עלול לגרום לדליפה של תוכן התא החוצה, תוך שחרור קומפלקסי ברזל ונחושת וכן אנזימים הידרוליטיים מתוך התא היכולים להגביר את התהליך בו נגרם נזק חמצוני לרקמה. לנזק בניגוד לחומצות שומן, ספציפי בו החלבון קשור למתכת מעבר. חלבונים פחות רגישים לחמצון ע"י רדיקלים. הידרופראוקסידים ופראוקסידים בחלבונים ישנה נטייה לנזק באתר מגיבים עם קומפלקסי מתכות המעבר בערכויות נמוכות תוך יצירת רדיקלי הידרוקסיל, אלקוקסיל ואנלוגים פעילים אחרים היכולים לגרום לנזק באתר הספציפי בחלבון בו הם נוצרו. גם ה DNA יכול לעבור חמצון ע"י רדיקלי הידרוקסיל או צורונים פעילים 16 אחרים המצויים בקרבתו. הרדיקלים יכולים להגיב עם הסוכר דאוקסיריבוז ולגרום לשבירת שרשרת הDNA או עם הבסיסים ב DNA ולגרום למוטציות בעת שכפול ה.DNA מנגנוני הגנה באופן עקרוני כל המולקולות האורגניות יכולות להיחשב כלוכדי רדיקלים. בגוף ישנם לוכדי רדיקלים הנקראים אנטיאוקסידנטים משום שהם מונעים חמצון של מולקולות ביולוגיות כגון סוכרים, חלבונים ושומנים. חומרים אלו לוכדים ישירות את הרדיקל הראשוני או מגיבים עם הרדיקלים המשניים ובכך מקצרים את תגובת השרשרת. כיוון שהרדיקלים הם צורונים מאוד לא יציבים ומגיבים מהר מאוד עם מולקולות, יכולת העיכוב של האנטיאוקסידנטים היא פונקציה של מהירות תגובתם עם הרדיקל, כאשר יש העדפה לתגובה הרצויה מבחינה תרמודינמית. 6

12 בגוף קיימות מס' מערכות המקטינות נזקי חמצון: מערכת אנזימטית הכוללת את,SOD קטאלז, וגלוטתיון פראוקסידז. המערכת השנייה היא מערכת של ויטמינים מסיסים בשומן כגון ויטמין E וויטמין, A או במים כגון ויטמין C. טבלה 1- סווג ותפקיד של מספר אנטיאוקסידנטים SOD קטלאז ויטמין E α-tocopherol C 29 H 50 O 2 ויטמין A C 30 H 20 O ויטמין C C 6 H 8 O 6 גלוטתיון מחוזר GSH C 10 H 17 N 3 O 6 S אנזימים ויטמינים אנטיאוקסידנט טבעי תוך תאי אנזים המנטרל את רדיקל הסופראוקסיד O 2.- ע"י דיסמוטציה (דיספרופורצינציה) של שני רדיקלי הסופראוקסיד, במהירות רבה לתת מי-חמצן וחמצן. 18 דיסמוטציה של מי-חמצן לחמצן ומים מעכב חמצון ליפידים ע"י לכידת הנוצרים בתהליך החמצון. מעכב חמצון ע"י לכידת בתהליך החמצון. מעכב חמצון ליפידים ע"י לכידת משניים הנוצרים בתהליך החמצון. מחזר אנטיאוקסידנטים שעברו חמצון מפורט בהרחבה בסעיף RNS,ROS ורדיקלים משניים RNS,ROS ורדיקלים משניים הנוצרים GS.,RNS,ROS ורדיקלים פעילותם של האנטיאוקסידנטים מתבטאת ב: 1. לכידת RNS,ROS ורדיקלים משניים הנוצרים בתהליך החמצון. 2. מניעת פעילותם הקטליטית של קומפלקסי מתכות המעבר בתהליכי חמצון ע"י קישור למתכת. לדוגמא, טרנספרין ופריטין קושרים ברזל ואילו צרופלסמין ואלבומין קושרים נחושת. 3. האטה בקצב החמצון של שומנים ע"י לכידה של הרדיקלים הפעילים ומניעת המשך תגובת השרשרת של חמצון השומנים. המערכות בגוף עובדות במשותף על מנת להוות מערכות הגנה מקסימליות. 7

13 איור 1- פעילות הדדית של אנטיאוקסידנטים והאינטראקציה ביניהם. C מסמל ויטמין VC ו E מסמל ויטמין VE,Reactive Oxygen Intermediates מסמל ROI עפ"י איור 1 הרדיקלים יוצרים תגובת שרשרת של חמצון שומנים, היכולה להסתיים ע"י פעולה של ויטמין E ובטא קרוטן. ויטמין E ממוחזר מחדש ע"י ויטמין C וגלוטתיון. יכולת החיזור של גלוטתיון מקוטלזת ע"י גלוטתיון פראוקסידז תוך יצירת גלוטתיון מחומצן העובר חיזור ע"י.NADPH למעשה, חלק מאנטיאוקסידנטים אלו כגון חומצה אסקורבית, גלוטתיון וויטמין E במצב המחומצן יכולים להוות גם פרואוקסידנטים כפי שיצוין בהרחבה בפרק 7. היכולת שלהם לשמש כפרואוקסידנטים נובעת מיכולתם לחזר מתכות מעבר וע"י כך לגרום להתרחשות תגובות דמויות פנטון או לחילופין, הרדיקל הנוצר לאחר הפעילות האנטיאוקסידטיבית שלהם יכול לגרום בעצמו לנזקי חמצון במערכות ביולוגיות. 1.3 עקה חמצונית במצב בו מופר האיזון בין מערכות ההגנה של הגוף לבין ייצור הרדיקלים נוצרת עקה חמצונית Oxidative).(Stress מצב זה יכול להיווצר ע"י ייצור מוגבר של רדיקלים או ע"י הפחתה בפעילות מערכות ההגנה השונות. עקה זו היא בעלת תפקיד חשוב בתהליכים פתולוגיים שונים כגון: טרשת עורקים, דלקת, יתר לחץ דם, רעלת הריון, סרטן ואלצהיימר. 1.4 מתכות המעבר וחשיבותן במערכות ביולוגיות יוני מתכות המעבר מהשורה הראשונה מהווים מרכיב חשוב בחלבונים מסוימים ומשמשים כקטליזטורים טובים לתגובות חמצון חיזור במערכות ביולוגיות. חלבונים המכילים מתכות מעבר נקראים Metalloproteins ואלו המקטלזים תגובות חמזור נקראים.Metalloenzymes היותם קטליזטורים טובים נובעת מהימצאותם של אלקטרונים באורביטלי d המאפשרים להם למסור ולקבל אלקטרונים בקלות וכך להיות יציבים במצבי חמצון שונים. 8

14 הקומפלקסים הנוצרים בין החלבון למתכות המעבר מהווים קטליזטורים בתגובות שונות ע"י קישור המתכת לאתר הפעיל. 19 במתכות החיוניות במערכות ביולוגיות נכללות בין השאר המתכות הבאות : קובלט הנמצא בוויטמין B 12 החיוני למטבוליזם של סוכרים, פחמימות וחלבונים, ניקל הנמצא בהידרוגנזות, נחושת הנמצאת ב cytochrome c.sod וכן באנזימים האחראים לפיגמנטציה ואבץ שהינו מרכיב חשוב באינסולין ונמצא גם ב SOD,oxidase תפקיד הברזל במערכות ביולוגיות ברזל הינו המתכת הנפוצה ביותר והחשובה ביותר במערכות ביולוגיות. הוא חיוני לצורך תהליכי חימזור בסיסיים כגון הנשימה התאית, יצירת אמוניה מחנקן וכו. חשיבותו הרבה של הברזל נובעת מן העובדה שהוא מהווה חלק מההמוגלובין והמיוגלובין שהינם נשאי החמצן. הברזל קשור לטבעת הטרוציקלית מישורית בשם פורפירין וביחד יוצרים את ה"הם" (heme) (איור 2). במערכת זו הברזל יציב גם במצב דו ערכי וגם בתלת ערכי אך יכול לקשור חמצן רק כשהוא במצב דו ערכי. הברזל מצוי גם באתר הפעיל בחלבוני הציטוכרום החיוניים במגוון תהליכי חימזור בגוף. לדוגמא ציטוכרום C מהווה חלק חשוב בשרשרת מעבר האלקטרונים בין (cytochrome c reductase) Coenzyme Q לבין.cytochrome c oxidase מנגנון הרעילות של רעלים שונים כמו ציאניד ואזיד נובע מקשירתם לברזל ועיכוב שרשרת מעבר האלקטרונים בתא, דבר שכידוע יכול לגרום למוות מיידי. ציטוכרום נוסף החיוני ביותר לגוף הינו P450 המשמש למטבוליזם של חומרים אנדוגנים ואקסוגנים ואחראי על 20 מטבוליזם של תרופות ונטרול רעלים. איור 2 21 מבנה ההם. (a) מבנה מפורט של ההם וקבוצות הקישור שלו בתוך מיוגלובין או המוגלובין. (b) השינוי הנוצר בהמוגלובין בקישור של מולקולת חמצן. בנוסף לפעילותו החיונית הברזל הינו גם שותף בתהליכים רדיקליים. תהליכים אלו אינם ייחודיים לברזל אלא אופייניים גם למתכות מעבר אחרות במערכות ביולוגיות כמו נחושת לדוגמה. הברזל מהווה קטליזטור בפירוק מי חמצן או פראוקסידים שונים המהווים מקור להיווצרות צורוני חמצן פעילים. רוב הקומפלקסים הביולוגיים שלו עם 9

15 ,DNA,ADP,ATP פחמימות וחומצות אורגניות הם קטליזטורים בפירוק ROOH או מי חמצן וליצירת רדיקלי אלקוקסיל.,RO הידרוקסיל, פראוקסיל. ROO או תוצרים מחמצנים אחרים. דוגמאות לכך הם קאטלז (תגובות (1.7) ו (1.8)) המקטלז את הדיספרופורציונציה של מי חמצן ופראוקסידז המקטלז חימצון ע"י מי חמצן תוך כדי הפיכתם למים. (1.7) H 2 O 2 + Fe III CAT H 2 O + OFe IV CAT (1.8) H 2 O 2 + Fe IV CAT OFe III CAT + O 2 + H 2 O כמות הברזל בגוף הינה כ 4-5 gr ורובו נמצא בתוך ההמוגלובין שבתאי הדם האדומים, כ 10% נמצא במיוגלובין ובציטוכרומים ו 20-30% נמצא בחלבון הפריטין שתפקידו לאגור ברזל. הברזל הנספג ממקור חיצוני מועבר ע"י חלבון הטרנספרין לפריטין שם הוא נאגר. 1.5 סוכרים וחשיבותם במערכות ביולוגיות הנוסחה הכימית הכללית של הסוכרים הינה C. n H 2n O n כמעט לכל אטום פחמן קשורה קבוצת הידרוקסיל ואטום מימן. השינוי בעמדה של קבוצת ההידרוקסיל מביא לשינוי בתרכובת. בנוסף לקבוצת ההידרוקסיל מכיל הסוכר גם קבוצה קרבונילית (CO) או אלדהיד.(CHO) הסוכרים אשר צורתם המקורית היא שרשרת ישרה יכולים להיסגר לטבעת ע"י תגובה תוך מולקולרית בין קבוצת קרבוקסיל או אלדהיד הנמצאת בקצה אחד של המולקולה להידרוקסיל בקצה השני. הסוכרים הם קראלים, ועל כן קיימים אננטיומריים המסומנים בסוכרים כ L ו D. אננטיומר D הינו ברירת המחדל של הטבע ולכן בגוף האדם קיימים רק אנזימים המסוגלים לפרק אננטיומרים מסוג D כמו לדוגמא סוכרוז D לעומת סוכרוז L שלא ניתן לפירוק. הסוכרים הפשוטים ביותר הם המונוסכרידים שלא ניתן לפרק אותם ליחידות קטנות יותר ומהווים את אבני הבניין של כל הסוכרים. דיסכריד מורכב מ 2 יחידות סוכר, אוליגוסכריד מורכב מ 3-6 יחידות ופוליסכריד מורכב מיחידות רבות של מונוסכרידים. הקישור בין מונוסכרידים הינו ע"י דחיסה של 2 יחידות הידרוקסיד ושחרור של מולקולת מים. התהליך הינו הפיך והקשר יכול להתנתק בתגובת הידרוליזה. הסוכרים הינם בעלי חשיבות רבה במערכות ביולוגיות. 1. התהליך החשוב ביותר הינו יצירת אנרגיה לתא ע"י חימצון של גלוקוז בתהליך הגליקוליזה. בתהליך זה ישנה יצירת נטו 2 מולקולות ATP המהוות את מקור האנרגיה של התא. Glucose + 2NAD + + 2ADP + 2Phosphate 2Pyruvate + 2NADH + 2H + + 2ATP + 2H 2 O 2. הסוכר הינו חלק חשוב ממולקולות חיוניות בתאים כגון הדאוקסיריבוז והריבוז המהווים חלק מה DNA וה RNA בהתאמה. ה DNA בנוי מ 2 שרשראות פולינוקלאוטידיות שכל אחת מורכבת מ 4 נוקלאוטידים. כל נוקלאוטיד מורכב מדאוקסיריבוז, קבוצת פוספט ובסיס: A (אדנין), C (ציטוזין), G (גואנין) ו T 10

16 (טימין). הנוקלאוטידים קשורים בינהם בקשר קוולנטי דרך הדאוקסיריבוז וקבוצת הפוספט. בין הבסיסים קיימים קשרי מימן והם אלו המחברים בין 2 שרשראות ה DNA ליצירת סליל כפול. 3. סוכרים משמשים גם לזיהוי ע"י קישורם לגליקופרוטאינים וגליקוליפידים הנמצאים על גבי ממברנת התא. החלק הסוכרי פונה לסביבה החיצונית וקובע את הספציפיות של אתר ההכרות. הסוכרים נקשרים בצורה ספציפית לוירוסים, בקטריות, אחראים על תקשורת בין תאים וכו'. רדיקלים גורמים לנזקים שונים לסוכרים היכולים לבוא לידי ביטוי בשבירת הקשרים הגליקוזידים ושינוי במבנה הפולימר. רדיקלי הידרוקסיל ידועים ביכולתם לפגוע בדאוקסיריבוז הכלול במבנה ה,DNA דבר היכול להביא לשבירה של שרשרת ה DNA ולגרום לנזק בלתי הפיך לתא. מספר התוצרים הרב המתקבל כתוצאה מתלישת המימן תלוי במקום התלישה באלימינציות ובשחלופים המתרחשים ובמיקום שבירת השרשרת לקבלת פרגמנטים שונים

17 2. מטרת המחקר במחקר זה נבדוק מנגנונים של תהליכי חימצון הנוצרים כתוצאה מפעילות רדיקלים או צורונים פעילים אחרים ונתמקד בעיקר בחקר מנגנון תגובת פנטון הידועה כתגובה הגורמת לנזקי חמצון רבים. באופן ספציפי נבדוק: 1. קינטיקה של תגובת פנטון ומציאת פרמטרי שפעול עבור התגובה 2. השפעת סובסטרטים אורגניים הגורמים ליצירת תגובת שרשרת 3. השפעת ליגנדים פוספטיים על קצב תגובת פנטון 4. מנגנוני ההגנה של אנטיאוקסידנטים כתגובה לחמצון דאוקסיריבוז (DR) ע"י רדיקל ההידרוקסיל. 12

18 3. שיטות ניסוייות 3.1 חומרים הנוזלים והמוצקים האורגניים והמלחים האי-אורגניים שבהם נעשה שימוש במדידות נקנו מחברות Aldrich ו- Sigma בדרגת ניקיון אנליטית ולא עברו תהליך ניקוי נוסף. התמיסות המימיות הוכנו ממים מותפלים שעברו ניקוי נוסף על-ידי העברתם דרך קולונת ספיחה במערכת milli Q של חברת Millipore והיו בהתנגדות גבוהה מ MΩ/cm 10. תמיסות ששימשו ליצירת רדיקלי הידרוקסיל במקור קובלט עברו בעבוע עם N 2 O בכדי לסלק חמצן ולהפוך את האלקטרונים הממוימים לרדיקלי הידרוקסיל. לפני הבעבוע הועבר N 2 O במלכודת וונדיום דו ערכי חומצית בכדי לסלק שאריות חמצן אפשריות. תמיסות ששימשו לבדיקת אפקט חמצן בתגובת פנטון עברו בעבוע עם חמצן ליצירת תמיסה רוויה בחמצן. 3.2 מכשור שיטות ספקטרופוטומטריות וקינטיקות המדידות הספקטרופוטומטריות מתבצעות בתחום ה- U.V./Vis בספקטרופוטומטר מדגם HP8452A מסוג."Hewlett Packard" המקושר לתוכנה ממוחשבת לעיבוד נתונים ולהצגת גרפים של חברת Diode Array במכשיר מתאפשרת מדידה של ספקטרום בתחום nm כל 2 nm בדיוק של ±1. nm לרשותנו תא אופטי עשוי קוורץ עם דרך אופטית של 1 ס"מ, וכמו כן תאים מיוחדים לערבוב ולעבודה בריווי חמצן או לעבודה בהעדר אוויר. מדידת מהירויות של תגובות בעלות זמן מחצית חיים של למעלה מ 30 שניות בוצעה על-ידי שימוש בתוכנה הקינטית של ספקטרופוטומטר זה מדידות באמצעות ה Stopped Flow מדידת קינטיקה של תגובות מהירות בעלות זמן מחצית חיים של מעל מילי שנייה ניתן לבצע ע"י שימוש במכשיר ה-.Stopped Flow במכשיר זה המגיבים מובלים בלחץ לתוך תא הערבוב מגיעים להרכב הומוגני ואח"כ ממשיכים לזרום לתא המדידה. לאחר מספר מילי שניות הזרימה מופסקת ע"י מזרק הנמצא מהצד השני שמפעיל את הספקטרופוטומטר למדידת הבליעה. המדידות בוצעו במכשיר Stopped Flow מסוג SX-18 MV של Applied.Photophysics הבליעות נמדדו באורך גל של 304. nm באיור 3 ניתן לראות מבנה סכמטי של מכשיר זה. 13

19 איור מבנה סכמטי של מכשיר ה Stopped Flow לצורך מדידת קינטיקה בלחץ גבוה השתמשנו במכשיר Stopped Flow הבנוי במיוחד למדידות בלחץ גבוה 24,25 שבו תא המדידה והערבוב מוכנסים לתא הממולא ב n-heptane המשמש ליצירת לחץ גבוה. הקינטיקות נמדדו בלחצים של atm ובאורך גל של 304. nm הבליעות נמדדו ע"י מחשב מתוצרת IBM ועיבוד הנתונים בוצע ע"י שימוש בתוכנות.OLIS KINFIT כל המדידות הקינטיות שבוצעו במכשיר ה Stopped Flow בוצעו בתנאים של סדר פסאודו ראשון כך שריכוז אחד המגיבים (מי חמצן או הברזל הדו ערכי) הינו בעודף של לפחות פי 10 מהמגיב השני סימולציות קינטיות סימולציות קינטיות בוצעו: 1. במטרה לבדוק את השינוי במנגנון בתנאים שונים, דהיינו, ריכוזים שונים של Fe(II) H 2 O 2, ו Fe(III) ע"י שימוש בקבועי המהירות הקיימים. בסימולציות נבדק המקור של יצירת Fe(III) במצב שבו יש עודף מי חמצן או עודף ברזל דו ערכי. בסימולציות השתמשנו בתוכנת Specfit32 בשיטת.Global Analysis 2. במטרה להעריך את אמיתות מנגנון תגובת פנטון שהוצע כאשר השתמשנו במגיבים של שיטת.FOX הזנו למחשב את התגובות המוצעות בסעיף 5.3.9, את קבועי הקצב לכל התגובות מלבד תגובות (5.9) ו (5.24) וכן ריכוזים שונים של החומרים איתם עבדנו. בסימולציות קיבלנו את ניצולות הברזל התלת ערכי 14

20 כפונקציה של הזמן והשווינו אותן לתוצאות הניסוייות. הסימולציות בוצעו בשימוש בתוכנת Pro-.Applied Photophysics של Global Analysis המבוססת על שיטת Kineticist II שימוש בקרינה מייננת ליצירת רדיקלים לצורך יצירת רדיקלים התמיסות הוקרנו ע"י מקור הפולט קרינת. γ מקור קרינת ה- γ הינו הרדיואיזוטופ שנמצא בתא 60 Co Gamacell 3500 נעשה לצורך קביעת ניצולת תוצרים. קצב הקרינה של מקור ה- γ תמיסת Fricke תוצרת חברת Noratom של הועדה לאנרגיה אטומית הנורווגית. השימוש במקור נמדד בשימוש בתמיסת היא תמיסה הרוויה באוויר והמכילה 26 Fricke (בכלים זהים ובאותו נפח שבהם התבצעו הניסויים). FeSO 4 בריכוז NaCl, M בריכוז M ו- H 2 SO 4 בריכוז 0.8. M יש להחזיק את התמיסה בחושך (למניעת תגובה פוטוכימית לחמצון הברזל הדו-ערכי). נבדקה הבליעה של +3 Fe באורך-גל של 304 nm כנגד בלנק של תמיסה לא מוקרנת ב- 20. ºC 27 עצמת ההקרנה חושבה לפי הנוסחה : הקרינה עצמת בראדים O. D.( Fe ε d G( Fe 3+ = 3 + ) ) ρ 9 כאשר: ε(304 nm) = 2,174 cm -1 M -1 d דרך אופטית בסנטימטרים gr/cm 3 צפיפות התמיסה וערכו: ρ G(Fe 3+ ) = מקור הקרינה היה בזמן הניסויים בעל קצב קרינה השווה ל- rad/min 3.3 שיטות הבדיקה בשיטת (FOX) Ferrous oxidation xylenol orange שיטת FOX נועדה למדוד ריכוזים נמוכים של פראוקסידים במערכות ביולוגיות. השיטה מבוססת על תגובת החמצון של מי חמצן ע"י ברזל דו ערכי ויצירת ברזל תלת ערכי הנקשר ל (xylenol orange) XO ויוצר קומפלקס צבעוני. הריאגנט מכיל ferrous ammonium sulfate, H 2 SO 4, XO וסובסטרטים אורגניים שונים. לאחר ערבוב הריאגנט עם מי חמצן מתקבלים ריכוזים של µm ברזל דו ערכי, 25mM,XO 100 µm 2-9 µm H, 2 SO 4 מי חמצן ו mm סובסטרט אורגני. התמיסות שהו 40 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן נמדדה ניצולת הברזל התלת ערכי באורך גל של 560. nm בחלק מן התמיסות ה XO הוסף רק בסוף התגובה לצורך בדיקה אנליטית של ריכוז הברזל התלת ערכי. 15

21 אנליזה לקביעת ריכוז מי-חמצן ריכוז מי החמצן נקבע עפ"י השיטה 29 היודומטרית באנליזה מערבבים תמיסת המכילה KI, NaOH, ammonium heptamolybdate עם תמיסה נוספת המכילה.potassium hydrogen phthalate הריכוזים הסופיים המתקבלים לאחר הערבוב הם: 0.02 M potassium hydrogen phthalate,0.08 M KI,0.01 M NaOH ו 3.2x10-5. M ammonium heptamolybdate תמיסה זו מערבבים עם מי חמצן שריכוזו נע בין M הוספת - מי החמצן מובילה ליצירת I 3 עפ"י התגובות (3.1) ו (3.2). (3. 1) 2I - + H 2 O 2 + 2H + I 2 + 2H 2 O (3. 2) I 2 + I - I הבליעה של I 3 נמדדת בספקטרופוטומטר באורך גל של 352 nm עם מקדם בליעה של - cm M 1-30, שיטת ה TBARS לצורך בדיקת Malondialdehyde (MDA) ותוצרים דמויי MDA הנוצרים במהלך חמצון (DR) Deoxyribose נשתמש בשיטת ה (TBARS).Thiobarbituric acid reactive substances שיטה זו פותחה 32,33 במקור על מנת למדוד ולכמת פראוקסידציה של שומנים. השיטה מבוססת על כך ש מולקולות (TBA) Thiobarbituric acid ונותן כרומגן בעל צבע ורוד (איור 4). MDA 2 מגיב עם S N OH HO N N CH CH CH N SH OH HO איור 4 מבנה הכרומגן הנוצר בעקבות קשור 2 מולקולות TBA ל MDA לאחרונה נמצא ששימוש בשיטה זו לבדיקת חמצון שומנים אינו מדויק מכיוון שחלק מה MDA נוצר בזמן החימום 32 ע"י שבירה של הפראוקסידים השומניים בנוכחות חומצה ומלח ברזל. שימוש בתגובת ה TBARS אפשרי גם על מנת לבדוק תוצרי חמצון של,DNA חומצות אמינו, סוכרים ופחמימות. כתוצאה מהחמצון נוצרים MDA ותוצרים דמויי MDA הנקשרים ל 2 מולקולות.TBA הוצע שתגובה זו שימושית גם עבור מדידת קבוע המהירות של רדיקל ההידרוקסיל עם סובסטרטים 30,31,34 אורגניים. בשיטה זו משתמשים ב DR שקבוע מהירות התגובה שלו עם רדיקל ההידרוקסיל ידוע ומוסיפים סובסטרט כלשהו למערכת. הקצב שבו רדיקל ההידרוקסיל מגיב עם מולקולת המטרה תלוי בקבוע הקצב של התגובה. הוצע שניתן להשתמש בשיטה זו לקביעה של קבועי קצב של אנטיאוקסידנטים עם רדיקלי הידרוקסיל ללא 16

22 שימוש בפולס רדיוליזה. הבליעה המתקבלת הינה פונקציה של מהירות תגובת ההידרוקסיל עם DR ועם האנטיאוקסידנטים ותלויה ביחס k 3.3 [DR] / (k 3.3 [DR] + k 3.4 [antioxidant]) (3.3) DR +. OH DR. + H 2 O k = M s (3.4) antioxidant +. OH radical products בניגוד למערכות ביולוגיות בהן ברזל ומי חמצן מכיל: הם הגורמים ליצירת צורון הגורם לחמצון,DR אנו נבדוק את מנגנון תגובת החמצון של DR והשפעת אנטיאוקסידנטים ע"י יצירת רדיקלי הידרוקסיל במקור קובלט. הריאגנט, mm DR בופר פוספט 0.1 M (NaH 2 PO 4 / NaOH) בבדיקת השפעת.pH 7.4 ב אנטיאוקסידנטים התמיסות הכילו גם NAC,GSH וחומצה אסקורבית בריכוזים של mm הנפח הסופי של התמיסות הוא 3. ml התמיסות עברו ריווי של 12 דקות ב N 2 O ולאחר מכן הוקרנו במשך שעה כך שריכוז רדיקלי ההידרוקסיל האינטגרלי היה 0.1. mm בניסוי בו נבדקה התלות בזמן ההקרנה התמיסות במשך הוקרנו שעות כך שריכוז רדיקלי ההידרוקסיל האינטגרלי נע בין mm בהתאמה. לאחר ההקרנה הוספנו 3 ml של 1% TBA המומס ב NaOH 50 mm ו.2.8% TCA 3 ml התמיסה חוממה במשך 20 דקות בטמפרטורה של 80 C תוך כדי ערבוב מתמיד. בחימום התפתח הצבע הורוד. לאחר מכן התמיסה קוררה במשך 20 דקות. הבליעה של MDA ותוצרים דמויי MDA נמדדה בספקטרופוטומטר באורך גל של 532 nm עם מקדם בליעה של M -1 cm התגובות בוצעו במיכלי זכוכית (bulbs) בעלי נפח של 15. ml לאחר מילויי מיכל הזכוכית הוא נסגר ע"י אטם septa) (rubber שהודק בנוסף על ידי מכסה אלומיניום cap) (aluminium והאוויר סולק מתוך המיכל על ידי הזרמת N 2 O דרכו במשך כ- 10 דקות. הגזים הוזרמו לתוך המיכל דרך מחט שהוחדרה דרך האטם ועודף הגז יצא דרך מחט נוספת שהוחדרה דרך האטם. H יצירת רדיקלים ע"י קרינה מייננת כאשר קרינה מייננת נבלעת בתמיסה מימית התוצרים הראשוניים 36 הם: e-, γ. OH ; H. ; e - aq ; H 2 ;H 2 O 2 ; H 3 O + ; OH - בכימיה של קרינות נמדדת הניצולת במושג G" "ערך המתייחס למספר מולקולות של תוצר כלשהו שנוצרו מבליעה של 100 ev אנרגיה ע"י התווך. מספר מולק ' A הנוצרות G A = 100eV הנבלעים על ידי המערכת ידועים ערכי G עבור התוצרים הראשוניים בתמיסות מימיות מהולות סתמיות: 36 17

23 e - aq + e - aq H 2 + 2OH - 1.3x10 10 G(. OH) = 2.65 ; G(H. ) = 0.60 ; G(e - aq) = 2.65 ; G(H 2 ) = 0.45 ; G(H 2 O 2 ) = 0.75 הערכים המדויקים של ערכי G תלויים בהרכב התמיסה. גדלה ולעומת זאת הניצולת של בריכוזים גבוהים של מומסים הניצולת של הרדיקלים ושל H 2 O 2 קטנה. התוצרים הראשוניים האלו פעילים מאוד ולכן, הם יכולים להגיב במספר רב של תגובות בינם לבין עצמם. בטבלה 2 נתונות התגובות העיקריות בין התוצרים הראשוניים לבין H 2 27 עצמם כולל קבועי המהירות. טבלה - 2 קבועי מהירות של תגובות של תוצרי קרינה ראשוניים של תמיסות מימיות בינם לבין עצמם קבועי מהירות תגובה (M -1 S -1 ) 3.0x10 10 e - aq + OH OH - 5.4x10 9 H + H H 2 5.3x10 9 OH + OH H 2 O 2 e - aq + H 3 O + H + H 2 O 2.3x x10 10 e - aq + H H 2 + OH - 3.2x10 10 H + OH H 2 O H 3 O + + OH - 2H 2 O 14.3x x10 10 e - aq + H 2 O 2 OH + OH - 4.5x10 7 e - aq + H 2 O 2 H 2 O + HO 2 OH + H 2 H 2 O + H 6.0x10 7 N 2 O המגיב במהירות עם האלקטרון יצירת רדיקלי ההידרוקסיל במטרה לעבוד עם רדיקל הידרוקסילי,, OH ריווינו את התמיסות בגז הממויים ויוצר רדיקל הידרוקסיל (תגובה (3.5)). (3.5) e - aq + N 2 O H 2O. OH + OH - + N 2 k = M s ריכוז N 2 O בטמפי 25 ºC בתמיסה מימית רוויה, הוא M 2.2 והוא גבוה בהרבה מריכוז האלקטרון הממויים, לכן כל האלקטרונים הממוימים יילכדו על ידי N 2 O וכתוצאה מכך המגיב העיקרי בתמיסות אלו יהיה רדיקל ההידרוקסיל. OH. ריכוז שאר הרדיקלים הנוצרים ע"י שימוש בקרינה מייננת הוא זניח ולכן כמעט ולא מהווה הפרעה. 18

24 R t חישוב ניצולות תוצרים לאחר הקרנה עוצמת מקור הקרינה במקור קובלט נקבעת ביחידות.rad/min כמו כן ידוע בקירוב ראשון כי 1000 rad עבור ניצולת של תוצר = 1 G נותן 1 x M תוצר. בהקרנה של תמיסה בעלת נפח מדויק הניצולת של התוצר P מחושבת לפי הנוסחה: ) t Gp = [P] / (R t - עוצמת מקור הקרינה ביחידות rad/min - t זמן ההקרנה בדקות בהקרנה של תמיסה הרוויה ב N 2 O נמצא ש האינטגרלי המתקבל הינו כ 0.1. mm 36 ~ 6.0 OH G כך שבהקרנה של שעה ריכוז רדיקלי ההידרוקסיל 19

25 4. מדידות קינטיות של תגובת פנטון 4.1 מבוא תגובות חמצון חיזור תגובות חימזור ניתוח מנגנוני תגובות ע "י מדידות קינטיות בקומפלקסי הצורונים והאלקטרון עובר דרך מתכות מעבר יכולים מערכת הקשרים להתרחש במנגנון ספירה פנימית שבו יש או במנגנון ספירה חיצונית שבו אין קשר כימי קישור 2 בין בין המגיבים והאלקטרון עובר ב."tunneling" לפי עיקרון Franck-Condon תנועת האלקטרון היא מאוד מהירה כך שלגרעין המתכת, לליגנדים ולממס אין מספיק זמן לתזוזה וריאורגניזציה. לפי תיאורית שכאשר 37 Marcus ניתן לחשב קבועי קצב עבור תגובות המתרחשות במנגנון ספירה חיצונית. בד"כ ניתן לומר קבועי הקצב המחושבים מתאימים למהירות המתקבלת ניסויית אזי התגובה מתרחשת במנגנון ספירה חיצונית. אם אין התאמה בין קבוע הקצב המחושב לניסויי משמע שהתגובה מתרחשת במנגנון ספירה פנימית. תגובה המתרחשת במנגנון ספירה פנימית הינה בהכרח מהירה יותר מאשר תגובה המתרחשת במנגנון ספירה חיצונית כיוון שאחרת הייתה מתרחשת במנגנון ספירה חיצונית פרמטרי שפעול אנליזה של פרמטרי השפעול ע"י מדידת הקינטיקה בתנאי לחץ וטמפרטורה שונים, יכולה לעזור בהבנת מנגנון התגובה. ניתן לבחון את פרמטרי השפעול במצב המעבר באותם מושגים תרמודינמיים המשמשים לקבוע את רווח האנרגיה בתגובה כגון אנתרופיה, אנתלפיה ואנרגיה חופשית. במצב זה מודדים את הפרש האנרגיה בין המגיבים לקומפלקס המשופעל השפעת השינוי בטמפרטורה על קצב התגובה אנתרופית שפעול שלילית מרמזת על תגובה אסוציאטיבית בה יש מעבר משני מגיבים ליצירת קומפלקס מעבר אחד. אנתרופית שפעול חיובית מרמזת על תגובה דיסוציאטיבית בה יש מעבר ממגיב יחיד או שני מגיבים למספר רב יותר של מגיבים. ערכי האנתרופיה יכולים להשתנות גם כתוצאה משינויים בסולבטציה או משינוי במספר אופני התנודה. עלייה בסולבטציה תגרום לירידה באנתרופיה בדומה לירידה במספר דרגות החופש אשר תגרום גם כן לירידה באנתרופיה. בד"כ ניתן לומר שבמנגנון דיסוציאטיבי יש שבירה של קשר אחד לפחות ולכן הם בעלי אנתלפיית שפעול גבוהה לעומת מנגנון אסוציטיבי שבו יש יצירה של קשר ולכן לרוב אנתלפית השפעול נמוכה. מנגנוני interchange שבהם הערכים של אנתלפית השפעול הם בין דיסוציאטיבי לאסוציאטיבי יש שבירה ויצירה של קשר בו זמנית. 20

26 השפעת השינוי בלחץ על קצב התגובה ומדידת נפח שפעול כאשר הקומפלקס הנוצר במצב המעבר הינו בעל נפח שונה מזה של המגיבים שינוי בלחץ משפיע על קצב התגובה ויכול לתת אינדיקציה על המנגנון הנחקר. נפח השפעול הינו ההפרש בין הנפחים החלקיים של מצב המעבר לבין V = V -Σ V R סכום הנפחים המולריים של המגיבים. במידה ונפח מצב המעבר קטן מנפח המגיבים אזי העלאת הלחץ תסיט את שיווי המשקל לכוון העלאת ריכוז מצב המעבר וקצב התגובה יעלה. כאשר נפח מצב המעבר קטן מנפח המגיבים המנגנון הינו מנגנון אסוציאטיבי. באופן דומה, במידה ומצב המעבר תופס נפח גדול יותר מהמגיבים אזי העלאת הלחץ תסיט את שיווי המשקל לכוון המגיבים וקצב התגובה ירד. כאשר נפח מצב המעבר גדול מנפח המגיבים המנגנון נחשב למנגנון דיסוציאטיבי. בנוסחאות להלן ניתן לראות את הקשר בין נפח השפעול והקינטיקה d Gº = Vºdp - SºdT Gº = -RTln(K)º הנגזרות החלקיות המתקבלות כאשר משאירים את אחד הפרמטרים (P או T) קבוע הן G ( ) T G ( ) P ln K ( ) P P T T = S = V V = RT באופן אנלוגי במצב המעבר G = -RTln(K) ln k ( ) p T 1 G = ( RT p ) T V = RT 2 (5 כאשר נוצר תוצר ביניים MXY (איור יציב פרמטרי השפעול הינם הסכום של תגובות ואנרגית השפעול הנמדדת הינה הסכום עבור 2 התגובות. איור 5 - השינוי באנרגית השפעול במצב שבו נוצר תוצר ביניים. אנרגיית השפעול נמדדת בנקודה העליונה 38 ביותר לאורך קואורדינטת התגובה והיא הסכום של שתי תגובות: האחת, היווצרות תוצר הביניים והשנייה יצירת התוצר הסופי. 21

27 4.2 תגובת פנטון לפני כמאה שנה דווח ע"י Fenton שברזל דו ערכי מקטלז באופן ניכר תגובת חמצון של חומצה טרטרית ע"י מי- 39 חמצן. מאז, התגובה בין ברזל דו ערכי ומי-חמצן נקראת תגובת פנטון. בשנת 1934 הציעו Haber and Weiss שתגובת המפתח במנגנון הינה תגובה (4.1) בה נוצר רדיקל ההידרוקסיל. (4.1a) H 2 O 2 + Fe(H 2 O) OH + OH - + Fe(H 2 O) 6 3+ k = (42-79) M -1 s -1 9 בנוסף הציעו ש (4.2) O Fe(H 2 O) 6 3+ Fe(H 2 O) O 2 והסכום של 2 התגובות נותן את תגובת הבר וייס (4.3) O H 2 O 2. OH + OH - + O 2 40 Bray and Gorin הציעו, לעומת זאת, שבשלב הראשון בתהליך פירוק מי חמצן ע"י ברזל נוצר יון הפריל (4.1b) H 2 O 2 + Fe(H 2 O) 6 2+ (H 2 O) 5 Fe IV =O 2+ + H 2 O al. Barb et כתבו מנגנון מפורט יותר על פירוק מי חמצן המקוטלז ע"י ברזל דו ערכי תוך שילוב מנגנון הבר ווייס 41 שבו רדיקל ההידרוקסיל הינו הצורון המרכזי הנוצר. (4.1) H 2 O 2 + Fe(H 2 O) OH + OH Fe(H 2 O) 6 (4.4) Fe(H 2 O) OH OH Fe(H 2 O) 6 (4.5).. OH + H 2 O 2 H 2 O + HO 2 (4.6) HO. 2 + Fe(H 2 O) Fe(H 2 O) 6 + HO 2 (4.2) HO. 2 + Fe(H 2 O) 3+ 6 Fe(H 2 O) O 2 + H + התגובה של קומפלקס מתכת מעבר בערכיות נמוכה ומי-חמצן האנלוגית לתגובת פנטון יכולה להתרחש לפי מנגנון "דמוי פנטון" תוך כדי יצירת רדיקלי הידרוקסיל: (4.7) H 2 O 2 + M n L m. OH + OH - + M n+1 L m 22

28 תגובת פנטון ותגובות דמויות פנטון ידועות כתגובות העיקריות המקטלזות היווצרות צורוני חמצן פעילים (ROS) 2,7,8,42 במערכות ביולוגיות. הפוטנציאל ההרסני שלהן נובע מן העובדה שבעקבות התגובה מתרחשת תגובת שרשרת הגורמת נזק לחלבונים, DNA וחומצות שומן. כפי שכבר נכתב, צורוני החמצן הפעילים נחשבים כגורם העיקרי לזקנה וכן אחראים למגוון מחלות ביניהן: סרטן, טרשת עורקים וכו'. 3-6 בחלק מהמערכות הביולוגיות שבהם יש אנזימים המכילים קבוצת הם ישנה הסכמה כללית על כך שהצורון הפעיל הנוצר בתגובת פנטון הינו יון הפריל. בנוסף לחשיבותה של תגובת פנטון במערכות ביולוגיות ישנו שימוש נרחב בריאגנטי פנטון גם בתעשייה בעיקר 46,47 בנושא הטיפול בפסולת ובשפכים. צורונים מחמצנים שיגיבו עם פסולת כימית ואורגנית. יקרים, באופן דומה, זיהומים במי תהום ובקרקע. 43 תגובת פנטון ותגובות דמויות פנטון הינן תגובות יעילות וחסכוניות ביצירת ברזל הוא זול יחסית וידידותי לסביבה. בהשוואה למחמצנים אחרים מי החמצן הם בטוחים ולא בנוסף ישנו שימוש בריאגנטי פנטון לצורך טיהור כתוצאה מחשיבותו הרבה של מנגנון פנטון ומנגנון "דמוי פנטון" עדיין מבוצעים מחקרים רבים בנוכחות קומפלקסי מתכות מעבר בערכויות נמוכות ומי-חמצן שמטרתם לבדוק את מנגנון התגובה המפורט ותוצרי הביניים הנוצרים. 46,48-50 בחלק מהעבודות הוצע שאכן נוצרים רדיקלי הידרוקסיל ואלקוקסיל ואילו במחקרים אחרים נטען שנוצרים קומפלקסי מתכות מעבר בערכיות גבוהה. Koppenol שונים מהרדיקל חקר את התגובה בין Fe II EDTA לבין מי חמצן והסיק שהתגובה מובילה לקבלת תוצרי חמצון 57 Goldstein.. OH Meyerstein אינה נכונה. Koppenol הראה של שב הראתה בעזרת המערכת FeEDTA-H 2 O 2 -formate הראה בעבודתו שעבור Fe II NTA לא נוצרים רדיקלי. OH. 52 כי מסקנתו של Kremer 54 Fe(H 2 O) 6 2+ ישנה יצירה של ברזל בערכיות גבוהה יותר. + (O 6 Cu(H 2 ו Cu I phen עם מי חמצן התוצר העיקרי אינו רדיקל ההידרוקסיל. באופן אנלוגי הראו שבתגובות 51, חישובים קינטיים ושיקולים תרמודינמיים חישובים קינטיים ושיקולים תרמודינמיים מעידים על כך שתגובת פנטון אינה יכולה להתרחש במנגנון ספירה 53 חיצונית ולכן היא מתרחשת במנגנון ספירה פנימית. הטיעון מבוסס על העובדות הבאות. בהנחה שהתגובה הראשונה במנגנון אכן מתרחשת במנגנון ספירה חיצונית ניתן לרשום: ולאחריו (4.7') H 2 O 2 + M n L m M n+1 L m + H 2 O 2 - (4.8) H 2 O 2 -. OH + OH - (4.9) OH - + H 3 O + 2 H 2 O Eº (4.9) = 0.84 V פוטנציאל החיזור הסטנדרטי של אינו ידוע, אך ניתן לקבוע את ('4.7) k על פי תיאורית מרכוס H 2 O 2 /H 2 O 2 - בשימוש בנוסחה: k (4.7') = (k aa k bb K (4.7') f) 1/2 23

29 (ln K ln( f ) = ' ) 2 k k ln Z aa bb 2 k aa ו k bb הם קבועי הקצב של החילוף העצמי 1. x10 11 M 1- s הינו תדירות ההתנגשות בין מגיבים שאינם טעונים ולפי מרכוס ניתן לומר שהוא שווה ל 1- Z - קבוע הקצב של החילוף העצמי של H 2 O 2 H/ 2 O 2 אינו ידוע אך צריך להיות נמוך מ 1- s 1 x10 9 M 1- שהוא הקצב הצפוי לתגובות מבוקרות דיפוזיה. מתוך חישובי פוטנציאל החימזור של תגובה ('4.7) ע"י הנוסחה: Eº (4.7') = Eº (4.6) - Eº (4.8) - Eº (4.9) והנחות שונות המתבססות על העובדה שפוטנציאל החימזור החד אלקטרוני של מי החמצן נמוך, ניתן להסיק >0 (4.7') Gº. ש (4.7') nfeº Gº (4.7') = - בשימוש בנוסחה והיות ש: Gº (4.7') = -RTln(K 4.7' ) Gº (4.7') >0 נגזר ש <1 4.7' K באמצעות קבוע שיווי 37 המשקל ניתן לחשב את קבוע הקצב של התגובה ע"י שימוש בתיאורית מרכוס. בהנחה שהתגובה מתרחשת במנגנון ספירה חיצונית. קבועי הקצב המחושבים של תגובות דמויות פנטון עבור מתכות שונות וליגנדים שונים נמוכים בהרבה מאלו המתקבלים בניסויים. מכאן ניתן להסיק שהתגובה לא מתרחשת במנגנון ספירה חיצונית אלא במנגנון ספירה פנימית. כלומר, מי החמצן מחליפים מולקולת מים בספירת הקואורדינציה של יון המתכת (תגובה (4.10)) ומעבר אלקטרונים מתרחש במנגנון ספירה פנימית. קבוע הקצב לתגובת חילוף ליגנד 2+ ולכן סביר שתגובה (4.10) תתרחש בקצב דומה לתגובה זו. קבוע הקצב עבור O) 6 Fe(H 2 הוא -1 s 59 2x10 6 M -1 הנמדד עבור תגובות פנטון (תגובה 4.1) נמוך בהרבה מקבוע הקצב של חילוף ליגנד בברזל ולכן ברור שתגובה נוספת שהיא איטית יותר מהווה את השלב קובע המהירות. ניסויים שונים הוכיחו שאין יצירת רדיקלי הידרוקסיל 50,51,53-56,60-62 ואלקוקסיל בתגובה על כן יתכן ונוצר קומפלקס של מתכת בערכיות גבוהה יותר תוך כדי אלימינציה של מולקולת מים (תגובה (4.11b)). במחקרים שהראו שאכן מקבלים רדיקלי הידרוקסיל (בתנאים בהם M n L m ו hedta או (M = Fe(II), L = edta המנגנון עובר דרך תגובות (4.10) ולאחריה בהם 63 (M = Fe(II),L = nta 52 (4.11a). לעומת זאת כאשר לא נוצרים רדיקלי הידרוקסיל (בתנאים ולכן ניתן להניח שהצורון שנוצר הינו קומפלקס של Fe(IV) המנגנון עובר דרך תגובות (4.10) ולאחריה (4.11b). ניתן לסכם ולומר שעל פי חישובים תרמודינמיים תגובה (4.10)) מתרחשת עבור כל הקומבינציות אך היווצרות רדיקלי הידרוקסיל שנויה במחלוקת ומשתנה כתלות במרכיבי התמיסה. עפ"י חישובים אלו הדרך הטובה ביותר לבטא את הצעד הראשון במנגנון היא בתגובה (4.10)). (4.10) H 2 O 2 + M n L m L m M n. H 2 O 2 or L m-1 M n. H 2 O 2 + L 24

30 קומפלקס הביניים הנוצר יכול להתפרק בתגובה הומוליטית (4.11a)), (תגובה בתגובה הטרוליטית (תגובה (4.11c)). או להגיב עם סובסטרט (תגובה (4.11b)) (4.11a) +L M n+1 L m +. OH + OH - (4.11b) L m-1 M n. H 2 O 2 (4.11c) +RH L m-1 M n+2 =O + H 2 O M n+1 L m + R. + H 2 O + OH - תגובות המשך אפשריות הן: (4.12). OH + M n L m HO-M n+1 L m (OH - + M n+1 L m ) k 4.12 (Fe 2+ aq )= 3.0x10 8 M ,64 s (4.13) L m-1 M n+2 =O + M n L m L 2M n+1 L m (4.14). OH + RH R. + H 2 O (4.15) L m-1 M n+2 =O + RH +L M n+1 L m + R. + OH ,60-63 התוצרים של תגובה (4.11) תלויים ביון המתכת המרכזי, בליגנד L, ב,pH בסובסטרט RH ובריכוזו. עבור המנגנון המוצע בתגובות (4.10), (4.11a) ו (4.11b) ובהעדר סובסטרט, (בהעדר תגובה (4.11c)) ניתן לכתוב את חוק הקצב: כאשר I =. OH/ Fe IV =O M = Fe(II), L = H 2 O d[ Fe K aq dt ] = 2k. [Fe H O ] = K [Fe H 2O 2 ] = 2+ [ H O ][ Fe [Fe H [ H aq 2 ] 2 2 O 2 ] O ][ Fe 2+ aq ] היות ותגובות (4.12) או (4.13) מהירות בהרבה מתגובה (4.11). בעודף Fe(II) במצב של שיווי משקל. [Fe H O ] = K 2. [Fe H O ] + K 2. K [Fe H O ] = ([ H O. 2 [Fe H O ][ Fe [ Fe 1+ K 2 2+ aq ] 0 2 [ Fe. 2 [Fe H O ])[ Fe ][ H O aq ] + aq ] ] = K aq [ Fe ] 2+ aq ][ H O 2 2 ] 0 25

31 d[ Fe 3+ aq dt ] = 2k 4.11 K K [ Fe aq [ Fe ][ H O 2+ aq ] 2 2 ] 0 d[ Fe d[ Fe 3+ aq dt 3+ aq dt ] ] = 2k = k4.11k [Fe H 2O 2 ] = 2 1+ K d[ H 2O dt 2 ] k4.11k = 2 1+ K [ Fe [ Fe [ Fe [ Fe 2+ aq 2+ aq 2+ aq 2+ aq ] [ H 2O ] ] [ H 2O ] 2 ] 2 ] k K [ Fe aq 0 k obs = K 4.10[ Fe aq ] 0 ] מכיוון שבעודף ברזל דו ערכי מקבלים תלות לינארית בריכוז הברזל ניתן לומר שקבוע שיווי המשקל K 4.10 הוא נמוך ולכן לא ניתן למדוד את קבוע שיווי המשקל וקבוע המהירות בנפרד. כיוון שקבוע שיווי המשקל הוא נמוך ניתן לומר ש 1>> aq] K 4.10 [Fe +2 וע"י כך לפשט את המשוואה k obs = k 4.11 K (4.10 [Fe 2+ aq] תגובות קומפלקסי ברזל תלת ערכי עם מי חמצן בעבודה זו נמצא שבתגובה דמויית פנטון של ברזל עם מי חמצן יכול להיווצר קומפלקס פראוקסו ברזל תלת ערכי (תגובה (4.16)). בנוסף, קומפלקס מסוג זה דווח בספרות עבור תגובה של ברזל תלת ערכי עם עודף מי חמצן כאשר L = edta כמו כן דווח על קיום קומפלקס מסוג זה עבור מספר מתכות מעבר בערכיות גבוהה. (4.16) Fe III aq + H 2 O 2 Fe III ( - O 2 H) aq קומפלקס זה יכול להיווצר גם בתגובה של ברזל דו ערכי עם רדיקל פראוקסילי (תגובה (4.17)) (4.17) M n L m + RO 2. L m M n+1 -OOR תגובה של רדיקל הפראוקסיל עם יוני מתכת בד"כ מהירה יותר שצוינו, בגלל שריכוז יוני המתכת גבוה יחסית לרדיקלים, ולכן מתחרה בהן ביעילות. תגובה בנוכחות ברזל דו ערכי עבור מתגובות בימולקולריות של רדיקל הפראוקסיל R = H; CH 3 ; CH 2 COOH; CH 2 CN; ונמצא שקבוע ש"מ -1 M K 4.17 ~ 200 כמעט ואינו מושפע 69 (4.17) נחקרה (CH 2 C(CH 3 ) 2 OH; CH 2 OH; CHCl 2 /CCl 3 ) מפוטנציאל החימזור השונה של כל אחד מהרדיקלים והינו גבוה מקבועי ש"מ המחושבים מפוטנציאלי החימזור של כל אחד מהרדיקלים. תוצאות אלו מעידות על כך שנוצר קומפלקס +2 H), 2 (O 5 Fe III -OOR שבו - ROO מיצב את 26

32 69 הברזל התלת ערכי. ייצוב זה קטן ככל שיש יותר קבוצות מושכות אלקטרונים על R. אפקט זה נובע מן העובדה ש - ROO פחות בסיסי, ולכן σ דונור חלש יותר. קבועי המהירות של ברזל דו ערכי, k 4.17 ) 1- s 2.6x10~) 6 M 1 קרובים לקבוע המהירות של חילוף של מים בספירת הקואורדינציה 70 דבר המרמז על כך שהשלב קובע המהירות הינו קצב חילוף הליגנד. קומפלקס הפראוקסיל הנוצר יכול להתפרק במספר תגובות: (4.18) (H 2 O) 5 Fe III -OOR 2+ + H 3 O + /H 2 O Fe(H 2 O) ROOH + H 2 O/OH - 69 (4.19) (H 2 O) 5 Fe III -OOR 2+ + Fe(H 2 O) 6 2+ Fe(H 2O) Fe(H 2 O) ROH (4.20) 2RO 2. products (4.21) RO 2. + (H 2 O) 5 Fe III -OOR 2+ Fe(H 2 O) products תגובה (4.19) היא תגובה דמוית פנטון בעלת קבוע קצב הדומה לקבוע הקצב של חילוף ליגנד בברזל. קבוע זה גבוה בהרבה מהאנלוגי עבור תגובת פנטון. דבר זה מרמז על כך שהקומפלקס המתכתי משפעל את הפראוקסיד 69 לתגובה דמוית פנטון קומפלקס ברזל-פראוקסו במערכות ביולוגיות במערכות ביולוגיות צורוני פראוקסו ברזל OOH) (Fe III - הינם תוצרי ביניים במספר תהליכי חמצון. כדוגמאות לכך ניתן לראות את ה- וכן מספר אנזימים וביניהם 71 cytochrome P450 בו הברזל קשור לפורפירין (איור 6) ואת התרופה- 72 iron bleomycin 73 methane monooxygenase וה 74.ribonucleotide reductase 27

33 איור הווצרות תוצר ביניים Fe III - OOH במהלך חמצון של סובסטרטים אורגניים ע"י ציטוכרום 450-P מבחינה גיאומטרית קומפלקסי פראוקסו ברזל הם בד"כ end on (סכימה 3) אך נמצא כי ע"י הוספת בסיס ניתן לקבל את הצורון.Fe(III)- O 2 הן צורון ההידרופראוקסיל והן הפראוקסיל משמשים כמודלים ספקטרוסקופיים 76 לתגובות של חמצן עם אנזימים המכילים ברזל שאינו פורפיריני. הדעה הרווחת היא שהצורון Fe(III)-η 2 O- 2 הינו מקור לפראוקסידים נוקלאופיליים הגורמים לחמצון הסובסטראט ע"י אנזימים בעלי ברזל פורפיריני כדוגמת ה-.aromatase Fe III O O H -H + O Fe III O O- or Fe III O Hydroperoxo η 1 or end-on η 2 or side-on סכימה - 3 קומפלקסי ברזל פראוקסיל 4.3 מטרת המחקר חקירת מנגנון תגובת פנטון וניסיון לאפיין את צורון הביניים הנוצר בתגובה. באופן ספציפי בדקנו את קצב התגובה בעודף מי חמצן ובעודף ברזל דו ערכי וכן מדדנו את פרמטרי השפעול עבור התגובה. 28

34 4.4 תוצאות ודיון מדידת קצב התגובה בתחילה נמדד קצב התגובה פעם אחת בעודף ברזל דו ערכי ופעם נוספת בעודף מי חמצן. קצב התגובה נמדד ע"י מדידת קצב היווצרות הברזל התלת ערכי בתגובה תוך שימוש במכשיר ה.stopped flow קצב התגובה בעודף מי חמצן (איור 8) אמור להיות זהה לקצב התגובה בעודף ברזל דו ערכי (איור 7) אך מצאנו שקצב התגובה היה שונה ובעודף מי חמצן קיבלנו התאמה לשתי תגובות (איור 9). 4,0 3,5 3,0 2,5 k obs, s -1 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 Fe, M ph ב 40 µm H 2 ו O M איור 7 קבוע הקצב המובחן בעודף.Fe(II) התמיסות הכילו Fe(II) 2.0 וטמפרטורה של.25º C 8 k 1 6 k obs, s k 2 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 H 2 O 2, M איור 8 קבוע הקצב המובחן בעודף מי חמצן. התמיסות הכילו M H 2 O 2 ו Fe(II) 100 µm ב.25º C וטמפרטורה של ph

35 ב( (א) ( איור 9 קינטיקה טיפוסית של התגובה בעודף מי חמצן. (א) התאמה ל 2 אקספוננטים. (ב) התאמה לאקספוננט יחיד. למטה ניתן לראות את הסטייה של הקינטיקה שהתקבלה מההתאמה. התמיסות הכילו , M H 2 O 2.25º C וטמפרטורה של (H 2 SO 4 ) ph 2.0, µm Fe(II) התגובה בעודף Fe(II) תלויה לינארית בריכוז ה Fe(II) בעלת קבוע קצב של -1 s.k 4.11 K 4.10 = 75.2 ± 0.6 M -1 בעודף מי חמצן, שבה הייתה התאמה לשתי תגובות (איור 9) התלויות לינארית בריכוז מי החמצן, קבוע הקצב k ועבור התגובה השנייה (k 4.11 K 4.10 ) = 84.7 ± 1.4 M - 1 s = 72.0 שהתקבל עבור התגובה הראשונה הינו 1- s ±. 1.6 M 1- התגובה הראשונה הינה תגובת פנטון (המורכבת מתגובות (4.10) ו (4.11)) והתגובה השנייה הינה כנראה התגובה של ברזל תלת ערכי הנוצר בתגובה עם מי חמצן שבה נדון בהרחבה בהמשך. הערך של השיפוע שהתקבל בעודף מי חמצן עבור התגובה הראשונה הינו אך בגלל היחס השונה בין קצב העלמות מי החמצן לקצב העלמות הברזל קבוע הקצב המובחן בעודף מי חמצן מחולק ל 2. 30

36 בעודף ברזל דו ערכי d[ Fe k obs 3+ aq ] dt = 2k d[ H 2O2 ] = = [2k 2 dt 2+ K [ Fe aq ] K 4.10 [ Fe 2+ aq ]][ H O 2 2 ] בעודף מי חמצן d[ Fe k obs 3+ aq ] dt = 4k d[ Fe = dt K [ H O aq 2 ] = [4k ] 4.11 K 4.10 [ H 2 O ]][ Fe 2 2+ aq ] הערכים שהתקבלו בעודף מי חמצן ובעודף ברזל דו ערכי שונים זה מזה וגבוהים מהערך שהתקבל ע"י קרמר 55,56 בתמיסות מהולות יותר -1 s. k = 55.4 M מדידת נפח השפעול במשוואת הקצב לא ניתן להפריד בין קבוע שיווי המשקל לקבוע המהירות של פירוק תוצר הביניים ומכאן נובע שנפח השפעול המתקבל הינו הסכום של השינוי בנפח המולרי כתוצאה מהיווצרות הקומפלקס והשינוי בנפח השפעול כתוצאה מפירוק הקומפלקס V obs = V (k 4.11 ) + V (K 4.10 ) גדול מכיוון שהנפח המולרי של H 2 O 2 שמחליף מולקולת מים בספירת הקואורדינציה של ברזל דו ערכי הינו רק במעט המגיבים. יותר מאשר זה של מים חשוב לציין שב (מבוסס על נתוני צפיפות) שבו עבדנו, אין ניתן לומר שנפח קומפלקס הביניים דיסוציאציה של המימן הקשור למי החמצן דומה מאוד לנפח ולכן קומפלקס V (K 4.10 ) ~ 0 O) 5 Fe (O 2 H)(H 2 ולכן ניתן להניח כי + ph 2.0 ph O) 5 Fe(H 2 O 2 )(H 2 ולא Fe(III) הביניים הנוצר הינו לעומת זאת, בקישור מי חמצן ל ב יש דיסוציאציה של המימן ומתקבל הצורון V obs V (k 4.11 ) O) 5 Fe(HO 2 )(H 2 (הרחבה בהמשך). 2+ ולכן על מנת למדוד את נפח השפעול מדדנו את השינוי בקבוע הקצב המובחן כפונקציה של השינוי בלחץ. נפח השפעול מתקבל מהשיפוע על פי הנוסחה: 31

37 ln k ( ) p T V = RT נפח השפעול נמדד גם בנוכחות H 2 אשר שימשה כחומצה במקום SO 4 HClO 4 כיוון שהחומצה הגפרתית יכולה להוות ליגנד לברזל וכך להשפיע על נפח השפעול המתקבל. התוצאות שהתקבלו מובאות באיור 10. 0,60 0,55 HClO 4 0,50 0,45 lnk obs 0,40 0,35 0,30 H 2 SO 4 0,25 0, P, atm איור 10 השפעת הלחץ על קצב התגובה בעודף ברזל דו ערכי. התמיסות הכילו Fe(II) 0.02 M ו 40 µm.25º C בטמפרטורה של atm לחץ (H 2 או SO 4 HClO 4 ) ב ph 2.0 H 2 O 2 נפחי השפעול שהתקבלו עבור התגובה של מי חמצן עם ברזל דו ערכי בנוכחות עודף ברזל דו ערכי בתמיסות המכילות H 2 SO 4 ו HClO 4 הם: HClO 4 V = -4.6 ± 0.6 cm 3 mol -1 H 2 SO 4 V = -5.8 ± 0.4 cm 3 mol -1 H 2 SO 4 מתוך התוצאות שהתקבלו ניתן לראות שנפחי השפעול HClO 4 עבור ועבור כלומר, דומים, לחומצה הגפרתית יש אפקט מינורי על נפח השפעול. הגרפים של נפחי השפעול שהתקבלו בעודף מי חמצן עבור התגובה של מי חמצן עם ברזל דו ערכי ועם ברזל תלת ערכי מוצגים באיור

38 ב( 0,75-0,3 0,70 0,65-0,4 ln k obs,1 0,60 0,55 ln k obs,2-0,5 0,50 0,45-0,6 0,40 0, P, atm -0, P, atm (ב) (א) איור 11 השפעת הלחץ על קצב התגובה בעודף מי חמצן. (א) התגובה הראשונה של מי חמצן עם ברזל דו ערכי. ( התגובה השנייה של מי חמצן עם ברזל תלת ערכי הנוצר בתגובת פנטון. התמיסות הכילו , M H 2 O 2.25º C בטמפרטורה של atm לחץ,(H 2 SO 4 ) ph 2.0, µm Fe(II) נפח השפעול שהתקבל בעודף מי חמצן עבור התגובה בין ברזל דו ערכי ומי חמצן הינו: V = -7.2 ± 0.4 cm 3 mol -1 השינוי בנפח השפעול עבור התגובה של ברזל תלת ערכי עם עודף מי חמצן הינו זניח ואין מגמה מסוימת. נפח השפעול בנוכחות עודף Fe(II) שונה במידת מה מזה המתקבל בעודף מי חמצן. הסיבה לכך נעוצה בעובדה שבנוכחות עודף מי חמצן קיימות תגובות נוספות (התגובות העוקבות לתגובה (4.16)) המשפיעות על קבוע הקצב המובחן, ראה בהמשך, ולכן משפיעות על נפחי השפעול הנמדדים. כיוון שבעודף מי חמצן יש תגובות נוספות המשפיעות על הערך הנמדד, ערך זה אינו מתייחס רק לתגובות הרצויות ולכן בניתוח התוצאות נתבסס על הערכים שהתקבלו בעודף.Fe(II) באופן כללי, ניתן לומר שיצירת קשר (במנגנון אסוציאטיבי) גורמת לשינוי שבין 1- mol 5 cm 3 עד 15- cm 3 בנפח השפעול. שבירה של קשר במנגנון דיסוציאטיבי גורמת לשינוי של 1- mol + 5 cm 3 עד 15+ cm 3 38 mol -1 בנפח השפעול. יחד עם זאת, שבירה של קשר שמביאה ליצירת יונים גורמת לשינוי של 1- mol 20 cm 3 38 mol -1 בנפח השפעול בגלל התכווצות נפח היונים שנגרם כתוצאה מהסולבטציה הנוצרת הודות עד -1 mol cm 3 למטען שלהם. בעודף Fe(II) התקבל נפח שפעול שלילי למרות שגם בפירוק ההומוליטי (יצירת רדיקל ההידרוקסיל וברזל תלת ערכי) וגם בפירוק ההטרוליטי (יצירת יון הפריל) ישנה שבירה של קשר. במקרה של יצירת רדיקל ההידרוקסיל (תגובה (4.11a)) ישנה יצירה של שלושה תוצרים אשר צפויה להגדיל את נפח התוצרים יחסית למגיבים, אך מצד שני יצירת ברזל תלת ערכי מביאה להתכווצות בנפח התוצרים. בפירוק ההטרוליטי כאשר נוצר יון פריל (תגובה (4.11b)) המטען על היון המרכזי הוא (4+) לעומת מטען הקומפלקס הכולל שהוא (2+). 33

39 נפח השפעול שהתקבל שלילי דבר התואם את הציפיות שלנו כיוון שאפקט הסולבטציה ביצירת יונים משמעותי יותר מאשר שבירה או יצירה של קשר. יחד עם זאת, הערך של נפח השפעול שהתקבל, 1- mol 5.8 cm 3 ~ אינו יכול לספק מידע בדבר התוצר הנוצר כיוון שביון הפריל איננו יודעים האם הקטנת הנפח הנוצרת כתוצאה מאפקט הסולבטציה מושפעת מהמטען על היון המרכזי (4+) או ממטען הקומפלקס (2+) ולכן איננו יכולים להבדיל בין התוצרים הנוצרים, ברזל תלת ערכי או פריל, מתוך הערך של נפח השפעול אנתרופיית השפעול ואנתלפית השפעול ניתן למדוד את אנתרופיית השפעול ואנתלפית השפעול ע"י בדיקת השפעת שינויי הטמפרטורה על מהירות התגובה T/1 כנגד עפ"י משוואת Eyring בהצבה של R*ln(kh/κRT) כאשר השיפוע הינו H ונקודת החיתוך הינה. S k kt H = ( κ ) exp( h RT S ) exp( R ) בדומה לחישוב נפח השפעול גם אנתרופיית השפעול המובחנת הינה סכום השינוי באנתרופיה כתוצאה מיצירת הקומפלקס בתגובת שיווי משקל ואנטרופיית השפעול עבור תגובת הפירוק של הקומפלקס הנוצר S obs = S (k 4.11 ) + S (K 4.10 ) 2+ ישנם מספר גורמים היכולים להשפיע על הערך של ) 4.10 (K ברור שיצירת הקומפלקס O) 5 Fe(H : S 2 O 2 )(H 2 צפויה לגרום לירידה באנתרופיה. בנוסף, היווצרות הקומפלקס מביאה לירידה במספר אופני התנודה של מי החמצן שיכולה גם כן להביא לירידה באנתרופיה. אנתרופית השפעול (( 4.11 S ) k) עבור תגובת הפירוק אמורה להיות חיובית הודות לשבירת קשר ועלייה במספר התוצרים אך הצורונים הנוצרים Fe(III)) או (Fe(IV) הינם בעלי מטען חיובי ולכן יביאו לעלייה בסולבטציה ולירידה באנתרופיה. התוצאות שהתקבלו עבור עודף ברזל דו ערכי מובאות באיור 12: -200 R*ln(kh/κRT), J/K mol ,0032 0,0033 0,0034 0,0035 0,0036 1/T, K איור - 12 השפעת הטמפרטורה על קצב התגובה בעודף ברזל דו ערכי. התמיסות הכילו 100, µm H 2 O K הטמפרטורה נעה בין ph 2.0 (H 2 SO 4 ) ב M Fe(II) 34

40 H = 43 ± 1 kj mol -1 S = -67 ± 4 J mol -1 K -1 התוצאות המתקבלות בעודף מי חמצן מוצגות באיור R*ln(kh/κRT), J/K mol k 2 k ,0032 0,0033 0,0034 0,0035 0,0036 1/T, K µm איור - 13 השפעת הטמפרטורה על קצב התגובה בעודף מי חמצן. התמיסות הכילו 0.01, M H 2 O K והטמפרטורה נעה בין ph 2.0 (H 2 SO 4 ) ב Fe(II) H 1 = 42 ± 1 kj mol -1 H 2 = 44 ± 3 kj mol -1 S 1 = -60 ± 4 J mol -1 K -1 S 2 = -61 ± 10 J mol -1 K -1 מתוך התוצאות ניתן לראות שאנתרופית השפעול הנצפית הינה שלילית גם בעודף מי חמצן וגם בעודף.Fe(II) הירידה באנתרופיה יכולה להיות מוסברת ע"י שילוב של עלייה בסולבטציה וירידה במספר אופני התנודה ביצירת הקומפלקס וכן העלייה בסולבטציה כתוצאה מיצירת Fe(III)) או.(Fe(IV) אפקטים אלו כנראה דומיננטיים על פני העלייה באנתרופיה המתרחשת כתוצאה מפירוק הקומפלקס ומעבר ל 2 תוצרים התגובה בין ברזל תלת ערכי ומי חמצן התגובה השנייה הנצפית בעודף מי חמצן תלויה לינארית בריכוז מי החמצן לברזל התלת ערכי הנוצר בתגובת פנטון (תגובה (4.16)). החמצן ולכן ניתן להניח שזו התגובה בין מי (4.16) Fe III aq + H 2 O 2 Fe III ( - O 2 H) aq + H 3 O + קבוע המהירות עבור התגובה השנייה הנצפיית הינו -1 s. k 4.16 = 72.0 ± 1.6 M -1 35